Одним из основных показателей состояния биологической системы является температура. Если у человека развивается какая-то инфекция, то температура его тела повышается (как правило, но не всегда), что является признаком ответной реакции иммунной системы на угрозу. Другими словами, по температуре можно определить примерное состояние организма. Проблема в том, что человек большой (буквально), а вот, например, нематоды в длину всего лишь около 1 мм. Измерить температуру столь малого организма было крайне сложно, однако ученые из университета Осаки (Япония) разработали методику, позволяющую решить эту проблему. Какие средства были использованы для реализации нанотермометра, что показали практические опыты, и где можно использовать данную разработку? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.
Основа исследования
Температура тела живого организма варьируется в зависимости от степени воздействия внутренних и внешних факторов. Мы привыкли, что температура окружающей среды напрямую влияет на температуру холоднокровных, посему ее значения меняются с завидной регулярностью. Однако даже у теплокровных при нормальных физиологических условиях наблюдаются температурные колебания, которые можно связать с гомеостатической терморегуляцией и энергетическим обменом.
Другими словами, тут отлично подходит шутка: «я не бездельничаю, я очень занятой человек на клеточном уровне». Если точно измерить температуру и ее динамику в субмикронном масштабе, то можно получить много информации касательно клеточной и молекулярной активности. Проблема в том, что с уменьшением объекта измерения увеличивается сложность его проведения (сложно засунуть в нематоду обычный термометр из аптеки).
Авторы исследования отмечают, что обычные электрические термометры не имеют субмикронного разрешения, а термография в ближнем инфракрасном диапазоне обычно помогает определять температуру поверхности биологических образцов, но не внутреннюю температуру.
Конечно, сейчас уже есть светоизлучающие нанотермометры (например, термочувствительные молекулярные зонды), которые способны преодолеть это ограничение. Но у такой методики также есть недостатки. Основной это долговременная устойчивость, а точнее ее отсутствие. Подобные устройства не могут точно измерять изменения температуры, которые протекают длительное время (скажем пару часов). Не говоря уже о токсичном воздействии на образец со стороны такого термометра.
В данном труде ученые описывают концепцию наноалмазного (ND от nanodiamond) квантового термометра, который обладает высокой точностью, устойчивостью и низкой токсичностью. Принцип его работы таков: датчик считывает температуру как сдвиг частоты оптически детектируемого магнитного резонанса (ODMR от optically detected magnetic resonance) дефектных центров азотных вакансий (NV от nitrogen-vacancy), который в основном возникает из-за теплового расширения решетки. Сенсорное ядро NV глубоко встроено в решетку алмаза и невосприимчиво к различным биологическим факторам окружающей среды. Внедрение этого квантового датчика в более сложные организмы позволяет считывать их тепловую активность на конкретном участке в режиме реального времени. Но процесс реализации такой техники сопряжен с рядом сложностей.
Нематода (круглый червь) вида Caenorhabditis elegans.
Многоклеточные модельные организмы, такие как черви Caenorhabditis elegans, нуждаются в специальной камере, способной вместить тело миллиметрового размера, а сами образцы необходимо быстро анализировать, чтобы сохранить их физиологическое состояние. Квантовые ND термометры движутся намного быстрее, чем в культивируемых клетках, даже если тело обезвожено, что требует использования алгоритма быстрого отслеживания частиц. Кроме того, позиционное перемещение ND и сложная структура тела вызывают существенные колебания обнаруженной интенсивности флуоресценции, что, вероятно, вызовет артефакты измерения температуры. Решение этих проблем на данном этапе исследования сопряжено с подгонкой устройство под индивидуальные особенности анализируемого образца. Вопрос универсальности и легкости в настройке будущего нанотермометра планируется рассматривать в дальнейших работах, а пока внимание было уделено самой концепции и основным принципам работы.
Небольшой ролик, рассказывающий о нематодах.
Результаты исследования
Основой нанотермометра является конфокальный флуоресцентный микроскоп, оборудованный установкой для микроволнового облучения (1А).
Изображение №1
ODMR азотных вакансий можно измерить как уменьшение интенсивности лазерно-индуцированной флуоресценции при применении спин-резонансного микроволнового возбуждения, поскольку спиновое возбуждение активирует нефлуоресцентный путь релаксации из возбужденного состояния в основное состояние (1В).
Камера, куда помещаются образцы, представляет собой одноразовую чашу со стеклянным дном, интегрированную в антенну, которая обеспечивает оптический доступ большой площади (диаметр 12 мм) и простоту использования (1C), подходящую для деликатных образцов, таких как стволовые клетки. Время от захвата червя Caenorhabditis elegans до начала фактического измерения составляет всего 15 минут. Это помогает сохранить жизнеспособность червя и способствует получению большего объема данных о его состоянии.
Кроме того, данная система эффективно объединяет быстрое отслеживание частиц и высокоточную оценку температуры в реальном времени по ODMR смещению NV центров.
При отслеживании частиц система измеряет интенсивность флуоресценции ND вдоль осей xyz микроскопа и фокусируется на соответствующем максимуме флуоресценции каждые 4 секунды (возможен более короткий интервал отслеживания), в течение которых температура оценивается со временем выборки от 0.5 до 1.0 секунды. (2А).
Изображение №2
Методов квантовой термометрии существует несколько, однако в данном труде был использован метод четырехточечных измерений ODMR. Этот метод предполагает, что количество фотонов, зарегистрированных на всех четырех выбранных частотах, линейно масштабируется в соответствии с изменениями обнаруженной интенсивности флуоресценции.
Однако, было обнаружено, что каждый последующий фотон показывает разницу в светочувствительности около ∼0.5%, что фактически создает существенные артефакты в оценке частотного сдвига (т.е. ∼300 кГц, что соответствует нескольким градусам Цельсия), особенно при низко-фотонном режиме.
Эти артефакты, скорее всего, возникают из-за зависимой от оптической мощности асимметрии спектра ODMR. Для точного измерения температуры сложных оптических динамических систем (т.е. биологических систем) от подобных артефактов необходимо избавляться. Поэтому в метод четырехточечных измерений был добавлен фильтр коррекции ошибок.
Для оценки работы системы, сопряженной с коррекцией ошибок, в реальном времени были проведены измерения температуры ND во время ступенчатых тепловых событий. Резкие изменения температуры использовать нельзя было, так как внезапные изменения температуры вызывают большую расфокусировку фокальных пятен и связанные с ними флуктуации интенсивности флуоресценции.
На 2B показаны временные профили общего количества фотонов (Itot) и температурная оценка ND (∆TNV), когда температура образца (TS) изменяется от 44.3° → 30.4° → 44.3° с шагом в ∼2.8°. Система точно выдает ∆TNV, соответствующий TS, при этом положение фокуса существенно перемещалось, особенно вдоль оси z на расстояние более 30 мкм (2C).
При шаге в 3° проявляется позиционный сдвиг по оси z на 6 мкм в течение 3-4 минут, но скорость слежения достаточно высока, чтобы следовать динамике — 105 нм/с в течение 96 минут (2С).
Кроме того, ∆TNV четко демонстрирует антикорреляцию с Itot. Статистическое исследование этого типа температурной зависимости определяет средние значения для SD: Itot-1dItot/dT = -3.9 ± 0.7 %/°С и dD/dT = — 65.4 ± 5.5 кГц/°С (2D). При этом точность измерения температуры составляет ± 0.29° и < 0.6 °C, соответственно, что дает чувствительность 1.8 °C/√Гц.
После достижения надежной и точной термометрии в реальном времени в рамках этапа разработки, был проведен тестовый локальный мониторинг температуры на живых червях.
Изображение №3
На снимке 3А показаны ND внутри анестезированных червей, помещенных рядом с микроволновыми антеннами. Эти ND хорошо диспергируются в воде за счет поверхностной функционализации полиглицерина (PG от polyglycerol) и вводятся путем микроинъекции в гонады (половые железы подопытного червя).
На графике 3В показан ODMR спектр одиночного ND (отмечен стрелкой на 3А). 3С демонстрирует временные профили Itot и ∆TNV за период в 1 час при изменении температуры TS.
Сначала проводилось измерение Tobj при 33.2 °С, через 6 минут было выполнено уменьшение до 25.3 °С. В результате Tobj достиг уровня 28.6 °С на 35.2 минуте. ∆TNV показал точное изменение температуры между двумя стационарными состояниями: 33.2 и 28.6 °С.
Отображение реальной динамики температуры внутри червей между этими двумя стационарными состояниями отображается за счет того, что ∆TNV всегда отстает от TS и демонстрирует немного заниженный отклик из-за конечной теплоемкости объектива микроскопа и окружающей среды. Itot также показывает постепенные изменения интенсивности флуоресценции, вызванные температурой.
Отслеживание частиц также выполнялось на удовлетворительном уровне (3С). В течение 0-15 минут в подсчитанных фотонах появляются частые всплески, возникающие из-за позиционных флуктуаций ND приблизительно на 400 нм в течение нескольких секунд.
Результаты теста отчетливо свидетельствуют о высокой точности измерения температуры внутри наноразмерной биологической системы в реальном времени. Далее было решено провести дополнительные тесты, перед которыми подопытные черви прошли фармакологическую обработку с помощью C10H5F3N4O (FCCP от карбонил цианид-4- (трифторметокси) фенилгидразон), вызывающую неподвижный термогенез (грубо говоря, повышение температуры ввиду увеличения метаболизма и без дополнительной мышечной активности).
Изображение №4
На снимке 4А показаны ND у червей, стимулированных FCCP. А на графике 4В показан временной профиль ∆TNV ND, отмеченного стрелкой на снимках.
На седьмой минуте после начала измерения был использован раствор FCCP. На 32-ой минуте ∆TNV начинает постепенно увеличиваться, а на 48-ой наблюдается еще большее дополнительное увеличение, когда уровень изменения температуры повышается от 4 до 7 °С. Состояние повышенной температуры длилось около 80 минут.
Во время стимуляции ND медленно перемещаются на несколько микрометров в течение часа, что подтверждает результаты отдельных экспериментов, в которых ND непрерывно наблюдались под микроскопом.
Контрольная группа червей (4С и 4D), которым не вводили FCCP, показала равномерный отклик ∆TNV во время всего теста без каких-либо явных изменений температуры.
Для дополнительного подтверждения того, что FCCP реально вызывает повышение температуры тела червей, была проведена количественная оценка червей с помеченными ND как в контрольной, так и в подопытной группе (4Е). График явно говорит о повышении температуры у червей из подопытной группы по сравнению с контрольной.
Другой контрольный эксперимент, в котором буферный раствор не добавлялся, а ∆TNV отслеживался статически, показывает, что добавление допанта вызывает колебания ∆TNV на определенном уровне либо из-за изменения температуры, либо из-за артефактов сдвига ODMR. Однако наблюдение подобного сдвига невозможно при добавлении FCCP, что дополнительно подтверждает повышение температуры за счет FCCP у подопытной группы червей (4F).
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
В данном исследовании ученым удалось разработать методику, позволяющую точно измерить температуру внутри наноразмерной биологической системы в реальном времени. Утрировано говоря, им удалось измерить температуру тела червя Caenorhabditis elegans, длина которого составляет примерно 1 мм.
Важно понимать, что измерить что-либо в большом образце гораздо проще, чем в малом. Тем не менее использование наноалмазов, вводимых в тело червей, позволило узнать температуру тела червя в обычных условиях. Эти наноалмазы, попадая внутрь тела, начинают быстро перемещаться. Специально разработанный алгоритм и конфокальный флуоресцентный микроскоп позволили отследить и проанализировать их движение. Полученные данные позволили точно определить температуру тела червя и ее динамику, даже после введения специального вещества, вызвавшего повышение температуры.
Данный труд не только показывает, что квантовые технологии могут и должны применяться в биологии, но и расширяет спектр возможностей в аспекте диагностики различных процессов на макроуровне. Очень часто состояние биологической системы напрямую или косвенно зависит от процессов, протекающих внутри клеток, измерить которые в реальном времени ранее было крайне сложно. Получив больше информации касательно составных элементов системы, можно лучше понять саму систему, что, естественно, позволит эффективнее влиять на ее работу.
Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Equinix Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
Комментариев нет:
Отправить комментарий